Química

Atualmente, tem se tornado comum a declaração de que a fase pré-analítica é responsável por cerca de 70% do total de erros ocorridos nos laboratórios clínicos que possuem um sistema de controle da qualidade bem estabelecido. A despeito de todas as dificuldades para a comprovação dessa afirmativa, a implantação, cada vez mais frequente, de procedimentos automatizados e robotizados na fase analítica permite assumi-la como verdadeira. A fase pré-analítica inclui indicação do exame, redação da solicitação, leitura e interpretação da solicitação, transmissão de eventuais instruções de preparo do paciente, avaliação do atendimento às instruções previamente transmitidas e procedimentos de coleta, acondicionamento, transporte e preservação da amostra biológica até o momento da efetiva realização do exame.

         Para que os resultados de alguns exames laboratoriais tenham valor clínico, deve ser registrado o horário de coleta e referido o uso de determinados medicamentos, incluindo tempo de uso, horário de tomada e dosagem. Outros exames exigem cuidados técnicos de procedimento de coleta, como o uso ou não do garrote, de tubos com ou sem anticoagulantes e conservantes específicos, a descrição exata do local da coleta. Em relação à coleta de sangue para a realização de exames laboratoriais, é importante que se conheçam, controlem e, se possível, evitem algumas variáveis capazes de interferir com a exatidão dos resultados. Classicamente, são referidas como condições pré-analíticas a variação cronobiológica, o gênero, a idade, a posição, a atividade física, o jejum, a dieta e o uso de drogas para fins terapêuticos ou não. O período de jejum habitual para a coleta de sangue de rotina é de 8 horas, podendo ser reduzido a 4 horas para a maioria dos exames, e, em situações especiais, tratando-se de crianças de baixa idade, pode ser de a 1 ou 2 horas apenas. É importante referir que o conceito de jejum diz respeito ao tempo no qual o indivíduo não recebe nenhum aporte calórico. Dessa forma, a ingestão de água não interrompe o período de jejum, mas a administração de nutrição, mesmo parenteral, deve ser considerada como possível interferente.

          Alguns parâmetros bioquímicos possuem concentração sérica dependente da idade do indivíduo. Essa dependência é resultante de diversos fatores, como maturidade funcional dos órgãos e sistemas, conteúdo hídrico, conteúdo lipídico, massa corporal, limitações funcionais da senilidade, etc.

A sistematização da fase pré-analítica e, principalmente, do processo de coleta evita uma série de erros, retrabalhos e desperdícios de amostras e de reagentes, evitando danos aos pacientes e à imagem da instituição e custos maiores e desnecessários. A realização de procedimentos padronizados e documentados, a qualificação técnica do produto e dos fornecedores; a avaliação da capacidade de disponibilização de suprimentos; a avaliação periódica dos insumos e registros de eventuais irregularidades referentes aos insumos, análise críticas dos fornecedores, garantem e asseguram a não interferência desses itens nas análises a serem realizadas.

Sequência de coleta pela CLSI H3-A6, Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard, 6th ed. recomendação para tubos de plásticos

1.      Frasco para hemocultura (meio líquido de soja-caseína enriquecido com CO2 e outros suplementos específicos para isolamento de microorganismo conforme os tipos de frascos).

2.       Tubo de citrato de sódio (dosagem de testes de coagulação).

3.       Tubo com ativador de coágulo, com ou sem gel para obtenção de soro.

4.      Tubo de heparina (dosagem bioquímica)

5.      Tubo de EDTA (dosagem de exames de hematologia).

6.      Tubo de fluoreto/EDTA (dosagem de glicose e lactato).

A importância da escolha e qualificação dos produtos implica na relação de custo-benefício, proporcionando melhor assistência aos pacientes, contribuindo para a confiabilidade dos resultados. Esta escolha impacta num alto nível de qualidade, evitando o trabalho sobre pressão, e consequentemente possíveis riscos ao paciente. A sistematização da fase pré- analítica implica em criar políticas e condições capazes de contribuir para que o profissional de saúde utilize sua capacidade e competência, ao máximo, para atender a população.

COLETA E ARMAZENAGEM DE AMOSTRAS DE SANGUE

   Vários fatores interferentes são relatados na literatura, como o tempo de contato prolongado do soro ou plasma com as células, existência de hemólise em grau variado, hemoconcentrações causadas por evaporação, temperatura incorreta de armazenamento da amostra, transporte incorreto, uso incorreto de aditivos (anticoagulantes), etc. O reconhecimento e a gerência dessas variáveis permite o estabelecimento de um controle efetivo na redução do erro e, portanto, uma melhor aplicabilidade dos resultados dos exames do paciente. As precauções universais estabelecem que qualquer material biológico é considerado potencialmente de risco. Dessa forma, medidas de segurança devem ser seguidas na manipulação das amostras. A separação do soro ou plasma das células sanguíneas deve ser realizada o mais rápido possível. Um tempo máximo de duas horas para essa separação deve ser seguido a fim de evitar interferências no potássio, hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), cortisol, catecolaminas, ácido láctico e homocisteína.

         A refrigeração da amostra a temperaturas entre 2 e 8ºC inibe o metabolismo das células e estabiliza certos constituintes termolábeis. A refrigeração de amostra entre 2 e 8ºC, quando se pretende dosar potássio, não deve exceder duas horas, uma vez que essa temperatura pode inibir a glicólise que alimenta a bomba de potássio e promover a saída do potássio para o meio extracelular, elevando o resultado do parâmetro. Portanto, uma amostra para dosagem de eletrólitos não deve permanecer a temperaturas entre 2 e 8ºC por mais de duas horas antes da centrifugação. Amostras para gasometria devem ser transportadas à temperatura entre 18 e 24ºC, com tempo máximo de transporte de duas horas. O uso de inibidores e preservativos, como fluoreto, pode prevenir a glicólise por um período de 24 horas à temperatura ambiente ou 48 horas em temperaturas entre 2 e 8ºC.

Durante o procedimento de coleta, devem ser evitados fatores que possam provocar hemólise. Dessa forma, é recomendado que os tubos permaneçam na posição vertical até a completa coagulacão do sangue, quando poderá ser centrifugado. A hemólise afeta substancialmente a dosagem de alguns elementos, como DHL, TGO (AST), potássio e hemoglobina. Outros elementos, como ferro, TGP (ALT) e T4 são moderadamente influenciados pela presença de hemólise. Outros, ainda, sofrem pequenas influências quando ensaiados em soros hemolisados, tais como fósforo, proteína total, albumina, magnésio, cálcio e fosfatase ácida.

COLETA DE URINA

 O exame de urina atual inclui, além do exame físico, as análises químicas e microscópicas. As análises químicas foram simplificadas, com a utilização da 54 química seca nas tiras reagentes, e a análise microscópica tem incorporado os benefícios da automação e da informatização, empregando metodologias de citometria de fluxo e de análise digital de imagens. O desenvolvimento de técnicas analíticas mais práticas e eficientes permitiu que o exame de urina de rotina se mantivesse como um dos testes mais frequentemente solicitados, seja para pacientes com diferentes queixas clínicas, seja para indivíduos saudáveis que se submetem a avaliação periódica, mesmo sem nenhuma sintomatologia.

        

         Por essa razão, o exame de urina de rotina deve ser entendido como um teste de triagem, capaz de fornecer informações úteis que possibilitam o diagnóstico de eventuais problemas nos rins e nas vias urinárias, como processos irritativos, inflamatórios ou infecciosos, além de alguns distúrbios metabólitos, como diabete melito e insípido, e distúrbios do equilíbrio acidobásico. Uma vez que diferentes substâncias são rotineiramente pesquisadas, é possível, também, a detecção de algumas condições mórbidas não diretamente relacionadas com os rins ou vias urinárias, como hemólise intravascular, algumas doenças hepáticas e de vias biliares, etc.

         A amostra ideal para a realização do exame de urina de rotina é a coletada no jato médio, com assepsia, e deve ser recomendada sempre que possível. Consiste em uma amostra correspondendo à porção intermediária do fluxo urinário coletado espontaneamente após assepsia genital. Devem ser desprezados uns poucos mililitros iniciais de urina, uma vez que podem conter secreções eventualmente presentes no terço distal da uretra e no meato uretral. No caso de o volume total colhido não ser muito grande, esta pequena contaminação, principalmente por leucócitos, pode induzir à interpretação equivocada dos resultados. Sacos coletores são frequentemente empregados na obtenção de amostras de urina de pacientes pediátricos ou geriátricos, nos quais o controle esfincteriano pode estar comprometido. Seu uso, aparentemente simples, deve ser realizado apenas por pessoal capacitado e bem treinado. Nos casos em que a coleta espontânea não seja possível e a amostra também seja utilizada para o exame de cultura, procedimentos mais invasivos, como o cateterismo vesical e a punção suprapúbica, devem ser considerados. A amostra coletada pela colocação de um cateter através da uretra até a bexiga, sob condições estéreis, é um recurso comumente utilizado para a realização de cultura para bactérias.

         Com a finalidade de serem minimizadas as variações pré-analíticas, o exame deve ser realizado em amostra de urina recentemente emitida, sem adição de nenhum conservante e mantida à temperatura ambiente. Quando as análises não forem realizadas em um prazo máximo de duas horas após a coleta, a amostra deverá ser refrigerada e protegida da luz. Nessas condições, em geral, a amostra mantém-se adequada ao exame por um período de até 12 horas, mas esse tempo deve ser definido pelo laboratório, considerando as características locais. A amostra nunca deve ser congelada. O laboratório deve fornecer frascos para a coleta de urina de 24 horas, os quais devem ser, preferencialmente, de plástico, opacos, de boca larga, inertes em relação à matriz biológica e adequados para conter um volume médio de 2,5 a 3 L, o que facilita a coleta e a homogeneização das amostras. Para a população pediátrica, podem ser utilizados frascos com capacidade média de 1 L.

GASOMETRIA






                A gasometria é usada para avaliar a oxigenação e o equilíbrio ácido-base. É pedida quando há um desequilíbrio ácido-base ou quando há problemas respiratórios. Podem ser pedidos outros exames ao mesmo tempo, como eletrólitos, para avaliar o equilíbrio eletrolítico, glicose, para pesquisar diabetes, e ureia e creatinina, para avaliar a função renal. Em pessoas recebendo oxigênioterapia, a gasometria é usada para monitorar a eficácia do tratamento. Resultados anormais da gasometria podem indicar que: O paciente não está recebendo oxigênio suficiente; não está eliminando dióxido de carbono em quantidade adequada; há um problema na função renal; há um problema metabólico. Os resultados dos outros componentes da gasometria são inter-relacionados e devem ser considerados em conjunto. Certas combinações de resultados fornecem uma indicação da causa da acidose ou da alcalose:


· A acidose respiratória se caracteriza por pH baixo e PCO2 alto, devido a dificuldade respiratória – pouco oxigênio é absorvido e pouco dióxido de carbono é eliminado. Isso tem muitas causas, incluindo pneumonia, doença pulmonar obpulmonar obstrutiva crônica e sedação excessiva.

· A alcalose respiratória se caracteriza por pH alto e PCO2 baixo, devido a hiperventilação causada por dor, sofrimento emocional e outros distúrbios.


 Na acidose metabólica, há diminuição do pH e do bicarbonato. As causas incluem diabetes, choque e insuficiência renal.

· Na alcalose metabólica há aumento do pH e do bicarbonato, que pode ocorrer com hipocalemia, vômitos crônicos com perda de ácido gástrico e infusão excessiva de bicarbonato.

FOTOMETRIA E ESPECTROMETRIA

A fotometria é a medida da intensidade luminosa ou a quantidade de luminosidade incidente em uma superfície. A espectrofotometria é a medida da intensidade da luz em comprimentos de ondas selecionados. O termo medida fotométrica foi originalmente definido como o processo utilizado para medir a intensidade de luz independente do comprimento de onda. Os instrumentos modernos, no entanto, isolam uma faixa estreita do comprimento de onda do espectro para as medições. Aqueles que utilizam filtros para este fim são referidos como fotômetros de filtro, enquanto aqueles que utilizam prismas ou grades são chamados espectrofotômetros. A principal utilidade analítica dos fotômetros de filtro ou espectrofotômetros é o isolamento e a utilização de regiões discretas do espectro para fins de medição.


FLUORIMETRIA


A fluorescência ocorre quando uma molécula absorve luz em um comprimento de onda e reemite essa luz em comprimento de onda maior. Um átomo ou molécula que apresenta fluorescência é considerado um fluoróforo. A fluorometria é definida como a medição da fluorescência da luz emitida. A análise fluorimétrica é um método muito sensível e amplamente utilizado em análises quantitativas na bioquímica clínica.

QUIMIOLUMINESCÊNCIA E BIOLUMINESCÊNCIA

A quimioluminescência é a emissão de luz quando um elétron retorna de um nível excitado ou superior de energia a um nível energético mais baixo. O evento excitatório é causado por uma reação química e envolve a oxidação 866 de um composto orgânico, como luminol, isoluminol, ésteres de acridina ou luciferina, com o auxílio de um oxidante, como peróxido de hidrogênio, hipoclorito ou oxigênio. A luz é emitida a partir de um produto excitado, formado pela reação de oxidação. Estas reações ocorrem na presença de catalisadores, tais como enzimas (fosfatase alcalina, peroxidase, etc.), íons metálicos ou de metais complexos e hemina. A bioluminescência é uma forma especial de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos. Na bioluminescêcnia, uma enzima ou uma fotoproteina aumenta a eficiência da reação de luminescência. A luciferase e a aquorina são dois exemplos desses catalisadores biológicos. O rendimento quântico (total de fótons emitidos por moléculas reativas totais) é de cerca de 0,1% a 10% para quimioluminescência e de 10% a 30% para a bioluminescência. Os ensaios de quimioluminescência são ultra-sensíveis (limites de detecção de atomole a zeptomole), apresentando uma faixa dinâmica ampla. Eles são agora frequentemente utilizados em imunoensaio automatizado e em ensaios envolvendo sonda de DNA.


ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA


A eletroquimioluminescência difere da quimioluminescência porque as espécies reativas que produzem quimioluminescência são geradas eletroquimicamente, por precursores estáveis, na superfície de um eletrodo. O quelato tris (bipiridil) rutênio é o marcador de eletroquimioluminescência mais comumente utilizado e a eletroquimioluminescência é gerada, em um eletrodo, a partir de um tipo de reação de oxidação-redução com tripropilamina. Este quelato é muito estável e relativamente pequeno e tem sido utilizado para marcar haptenos ou grandes moléculas (proteínas ou oligonucleotídeos). O processo de eletroquimioluminescência tem sido utilizado em ensaios imunológicos e de ácidos nucleicos. A vantagem desse processo consiste na prepara- 867 ção simples, na alta estabilidade dos reagentes em uma grande sensibilidade. A utilização desse processo proporciona limites de detecção de 200 fmol/L e uma escala dinâmica, que se estende por seis ordens de magnitude.

CONDUTOMETRIA


É uma técnica eletroquímica utilizada para determinar a quantidade de um analito presente em uma mistura, medindo o efeito dele sobre a condutividade elétrica da mistura. Essa é a medida da capacidade dos íons em solução de transportar corrente sob a influência de uma diferença de potencial. Em uma célula condutométrica, o potencial é aplicado entre dois eletrodos metálicos inertes. No laboratório clínico, a condutometria é frequentemente utilizada para medir o hematócrito.

ELETROFORESE


Eletroforese é um termo abrangente que se refere à migração de partículas ou solutos carregados em um meio líquido sob a influência de um campo elétrico. Iontoforese é um termo similar, mas se aplica somente à migração de íons pequenos. Eletroforese de zona é a técnica mais utilizada nos dias atuais em análises clínicas. Nesta técnica, as moléculas carregadas migram em zonas, normalmente em um meio de suporte poroso, com um gel de agarose, após a amostra ter sido misturada a uma solução tampão. É gerado um eletroferograma, uma representação de zonas proteicas, cada uma finamente separada das zonas vizinhas, sobre o material de suporte. As zonas de proteína são visualizadas quando o meio de suporte é corado com um corante específico para proteína, o meio é então seco, e as zonas são quantificadas em um densitômetro. O meio de suporte é seco e mantido como um registro permanente.

CROMATOGRAFIA


A cromatografia é utilizada no laboratório clínico para separar e quantificar vários analitos clínicos relevantes como a hemoglobina glicada (muito utilizada para acompanhamento do paciente diabético). Aparelho de eletroforese; utilizado para separação de proteínas. A cromatografia é um método físico de separação no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases: uma delas é estacionária, enquanto a outra se movimenta em uma direção definida (móvel).